摘要：目的对淡豆豉炮制中影响γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）富集的主次因素进行初步研究，为揭示淡豆豉高含量GABA的形成机制奠定基础。方法用常规方法测定淡豆豉炮制过程中pH值、温度、水分、蛋白酶和谷氨酸脱羧酶（glutamicaciddecarboxylase，GAD）等指标的动态变化，用本实验室建立的柱前在线衍生法测定各样本GABA含量，通过SPSS统计软件对各指标与GABA进行相关性分析。结果相关性分析和多元回归分析结果表明，淡豆豉炮制过程中水分和酸性蛋白酶与GABA相关性系数分别为0.和?0.，P值分别为0.和0.，相关性较小且无统计学差异；比较回归系数绝对值的大小可知，其他各指标在GABA形成中的主次地位为pH值（?0.）＞温度（?0.）＞GAD（0.）＞碱性蛋白酶（0.）＞中性蛋白酶（?0.），其中pH值、温度和中性蛋白酶与GABA具有负相关性，GAD活力和碱性蛋白酶与GABA存在正相关性。结论淡豆豉炮制过程中温度、pH值、GAD、中性及碱性蛋白酶是影响GABA形成的重要因素。

淡豆豉SojaeSemenPraeparatum是一味常用传统中药，为豆科植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的成熟种子的发酵加工品，以黑色种皮品系大豆为主要原料，桑叶、青蒿为辅料配以其中经发酵炮制而成。具有解表除烦、宣发郁热之功效，临床上主要用于治疗感冒、头痛、烦躁胸闷、虚烦不眠[1-2]。历代本草和历版《中国药典》记载的淡豆豉制法中均包括“黄衣上遍”和“再闷”2个主要环节。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）是一种广泛分布于自然界的非蛋白质天然氨基酸，是哺乳类动物中枢神经系统中首要的抑制性神经递质。研究表明GABA具有降血压、调节血脂、促进睡眠和增强记忆力及改善脑功能等多种生理机能[3]，与淡豆豉功效谱相同或更优。本课题组前期首次发现淡豆豉炮制中的“再闷”环节产生高含量GABA[4]。目前大多数学者认为淡豆豉的主要活性成分是大豆异黄酮类，以至于研究者在淡豆豉的质量评价、主要活性成分及炮制工艺等研究中仅以大豆异黄酮类含量为指标，认为炮制工艺中可省去“再闷”环节。本课题组前期研究表明“再闷”环节极其重要[5]，“再闷”阶段出现高含量GABA，再次印证了“再闷”的重要性。有必要探讨淡豆豉炮制中GABA的形成机制。已报道GABA由谷氨酸脱羧酶（glutamicaciddecarboxylase，GAD）催化谷氨酸（glutamicacid，Glu）形成[6]，谷氨酸由蛋白酶水解大豆蛋白质生成，其专一性催化酶GAD和蛋白酶的活性受环境pH值、温度、水分等的影响[7]。推测淡豆豉炮制过程中高含量GABA的形成与这些因素有密切关联。基于此，本实验对淡豆豉炮制中影响GABA富集的主次因素进行了初步研究，为揭示淡豆豉中高含量GABA的形成机制奠定基础，并对完善淡豆豉炮制工艺、质量控制、使淡豆豉成为摄取GABA的新资源等有重要意义。

1仪器与材料

BSS电子天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司；MILLI-Q超纯水仪，美国Millipore公司；SIGM2-16K高速低温离心机，Sigma公司；PHS-25型数显pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；UV-C紫外可见分光光度计，优尼柯上海仪器有限公司；T10-standard高速匀浆机，IKA公司。

黑大豆、桑叶、青蒿均购自安国冷背药材有限公司，由江医院杨安金主任中药师鉴定，分别为豆科大豆属植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的成熟种子，桑科桑属植物桑MorusalbaL.的干燥叶，菊科蒿属植物黄花蒿ArtemisiaannuaL.的干燥地上部分。

GABA对照品，批号，质量分数99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；L-谷氨酸，批号，上海山浦化工有限公司；干酪素，批号，上海展云化工有限公司；L-酪氨酸，批号，上海蓝季科技发展有限公司；福林酚，批号HF，合肥博美生物科技有限责任公司；苯甲基磺酰氟（PMSF），批号Y01S6K，上海源叶生物科技有限公司。

2方法

2.1淡豆豉的炮制和取样

本课题组前期按《中国药典》年版建立了规范的淡豆豉炮制工艺[5]。炮制过程简述如下：取桑叶90g、青蒿g，分次加入10、8倍生药量的水煎煮1h，滤过，合并滤液并浓缩至0mL，煎液拌入净黑大豆0g中，待吸尽后，隔水蒸1.5h（此时取样1次，为发酵0d样品，记为F0），取出，稍晾，置容器内，用煎过的桑叶、青蒿渣覆盖，置温度（30±2）℃、湿度70%的培养箱内发酵6d至豆粒表面均匀布满黄衣（称“黄衣上遍”，此过程每3天取样1次，为发酵3、6d样品，记为F3、F6）。洗去黄衣，装入陶瓷容器中，置温度为（30±2）℃的培养箱再闷15d，再闷期间每3天倒出，翻动（此过程在再闷第3、6、9、12、15天取样，记为Z3、Z6、Z9、Z12、Z15），至充分发酵，香气溢出时取出，略蒸，干燥，即为淡豆豉成品。成品性状：表面黑色，皱缩不平，质柔软，断面棕黑色，气浓郁，味微甘。成品性状和各项理化指标均符合《中国药典》年版要求。各样品置于4℃保存。

2.2GABA含量测定

本课题组已建立淡豆豉中GABA定量检测的柱前在线衍生-高效液相色谱法[4]，其衍生试剂为邻苯二甲醛（OPA），GABA的线性回归方程为Y＝.2X＋2.，r2＝0.，在12.5～.0μg/mL范围内线性关系良好，精密度、稳定性、重复性、加样回收率等均符合要求[4]。用该法对淡豆豉炮制过程中不同时间点样本的GABA含量进行了检测。

2.3pH值的测定

取淡豆豉炮制过程中不同时间点样品5g，加入蒸馏水10mL充分搅拌均匀，用pH计测定悬浮液的pH值。

2.4温度的测定

将温度计置于发酵内部不同3处测定温度取平均值。

2.5水分的测定

直接干燥法。精密称取各样品5g，置℃烘箱烘至恒定质量计算水分量。

2.6蛋白酶活力的测定[8]

2.6.1酶液的制备称取各样品粉末于3支试管中，每管1g，分别加入5mLpH3.0乳酸-乳酸钠缓冲液、pH7.5磷酸盐缓冲液及pH10.5硼砂缓冲液用于提取酸性、中性及碱性蛋白酶。40℃水浴1h，0r/min离心20min，上清液即为粗酶液。

2.6.2酶活测定取编号1～6的6支试管，各管均加入粗酶液及相应缓冲液1mL预热1min，在1～3号试管中加入1mL1%干酪素溶液，4～6号试管中加入2mL0.4mol/L三氯乙酸溶液，精确保温10min，然后立即在1～3号试管中加入2mL0.4mol/L三氯乙酸，4～6号试管中加入1mL1%干酪素溶液，继续保温20min，离心。取上清液1mL加入5mL0.4mol/L碳酸钠溶液和1mL福林酚试剂，混匀，40℃保温发色20min，测定nm处吸光度。以1g或1mL酶量在40℃水解干酪素每1min产生1μg酪氨酸为1个酶活力单位（U）。

2.7GAD活力测定

2.7.1GABA含量测定比色法测定[9]。

2.7.2酶液的提取[10]取适量各样品于研钵中，加入少量石英砂研磨，称取1g样品于10mL试管中，加入5mLGAD提取液［pH5.8磷酸钾缓冲液，内含1mmol/LPLP（磷酸吡哆醛），1mmol/LPMSF（苯甲基磺酰氟），2mmol/LEDTA（乙二胺四乙酸），0.2%β-巯基乙醇，10%丙三醇］，于高速分散器中以r/min匀浆10min，4℃、00r/min离心10min，上清液即粗酶液，稀释相应倍数，备用。

2.7.3酶活测定取“2.7.2”项下制备的粗酶液μL，加入μL10mmol/LL-谷氨酸溶液，于37℃水浴2h，然后沸水浴5min，加入μL磷酸钾缓冲液，4℃00r/min离心10min，取上清液按“2.7.1”项方法测定GABA含量，定义每小时反应生成1μmolGABA为1个酶活力单位（U）。

2.8统计学分析[11-12]

应用SPSS21统计软件进行相关性分析，并进行多元线性回归。用Pearson相关系数分别对各指标与GABA含量的相关性进行评价，用双尾检验法评价显著水平。用r2对线性回归模型进行评价，F检验法评价其回归方程的显著性。在此基础上建立多元回归方程，通过比较各因素系数绝对值的大小，明确各指标在GABA形成中的主次地位。

3结果与分析

3.1淡豆豉炮制中不同时间点样本的GABA含量动态变化

应用柱前在线衍生-高效液相色谱法测定了淡豆豉炮制过程中各样本的GABA含量，结果黑大豆、F0、F3、F6、Z3、Z6、Z9、Z12、Z15、Z18、Z20中GABA质量分数分别为0.40、0.61、0、0、1.39、2.82、3.32、4.01、4.58、5.52、5.47mg/g。在炮制前原料黑大豆中含有微量GABA，进入“黄衣上遍”阶段未检测出GABA，洗去黄衣进入“再闷”阶段后，GABA含量逐渐增加，至再闷18d后含量稳定。基于《中国药典》年版对淡豆豉制法和性状等要求并结合本课题组前期研究结果[5]，故本课题组后续研究以炮制至再闷15d为宜。

3.2pH值

淡豆豉炮制过程中环境pH值会发生变化，F0、F3、F6、Z3、Z6、Z9、Z12、Z15对应的环境pH值分别为6.42、6.72、7.31、6.48、6.27、6.01、6.08、5.85。在整个炮制过程中发酵环境偏弱酸性，从发酵3d到发酵6d时pH值从弱酸性到中性及弱碱性，在发酵6d时pH值最高，为7.31；进入“再闷”环节后pH值逐渐降低，于再闷15d时达最低值，pH值约为5.85。

3.3温度

淡豆豉炮制过程中温度同样发生变化，F3、F6、Z3、Z6、Z9、Z12、Z15对应的温度分别为37、32、30、29、29、28、27℃。总体呈现逐渐下降的趋势，在发酵3d时最高，达37℃，之后逐渐降低。表明“黄衣上遍”阶段的微生物更适合在温度较高的环境生长，而“再闷”阶段的微生物适合在29℃左右的环境中生长。

3.4水分

淡豆豉炮制过程中水分会发生明显变化，F0、F3、F6、Z3、Z6、Z9、Z12、Z15样品的水分分别为57.22%、50.44%、29.60%、38.92%、43.44%、40.64%、43.02%、42.78%。炮制体系中水分先降低后增加最后趋于稳定。在“黄衣上遍”阶段水分逐渐降低，在发酵6d时最低，进入“再闷”阶段体系湿度又逐渐增加最后趋于稳定。

3.5蛋白酶活力

3.5.1L-酪氨酸标准曲线的建立取L-酪氨酸标准溶液按一定体积稀释至质量浓度为10、20、30、40、50μg/mL，采用福林酚法于nm波长处测定吸光度（A）值，其线性回归方程Y＝0.X＋0.，r2＝0.，表明L-酪氨酸在10～50μg/mL线性关系良好。

3.5.2蛋白酶活力不同样品黑大豆、F0、F3、F6、Z3、Z6、Z9、Z12、Z15中的酸性蛋白酶活力分别11.04、1.26、9.00、11.89、11.38、8.66、11.12、11.04、7.81U/g；中性蛋白酶活力分别为14.10、9.34、39.52、.56、65.71、24.22、17.07、12.74、11.04U/g；碱性蛋白酶活力分别为5.17、2.79、48.28、69.20、32.81、26.51、25.24、24.30、9.51U/g。酸性蛋白酶活力总体呈现先降低后增加的趋势，发酵前由于蒸煮过程使大部分酶活力丧失，“黄衣上遍”阶段酶活逐渐增加，进入“再闷”阶段酶活变化幅度较小，发酵6d和再闷12d时酶活相对较高；中性蛋白酶活力随炮制时间的延长呈先小幅降低后大幅增加再降低的趋势，在发酵6d时达到最高，为.56U/g；碱性蛋白酶活力随着炮制时间的延长亦呈现先减后增再减趋势，在发酵6d时碱性蛋白酶活力达最高，为69.20U/g。

3.6GAD活力

3.6.1GABA标准曲线的制作取GABA对照品溶液按一定体积稀释至溶液浓度为0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0μmol/mL，用显色剂显色后于nm波长处测定A值。以GABA浓度为横坐标（X），A值为纵坐标（Y）制作标准曲线，标准曲线方程为Y＝0.X＋0.，r2＝0.，表明GABA在0.4～3.0μmol/mL线性关系良好。

3.6.2GAD酶活力不同样品黑大豆、F0、F3、F6、Z3、Z6、Z9、Z12、Z15中的GAD酶活力分别为0.59、0.24、0.58、1.69、6.33、7.50、9.24、11.21、17.64U/(g?h)。淡豆豉炮制过程中GAD酶活力总体呈现先减后增的趋势，“黄衣上遍”阶段GAD酶活力极低，发酵0d时酶活力最低，约为0.U/(g?h)；进入“再闷”后GAD酶活力逐渐增加，于再闷15d时酶活力达最高值，为17.64U/(g?h)。

3.7统计学分析

淡豆豉炮制过程中各指标的变化见表1。以淡豆豉炮制过程中各个指标含量为横坐标（pH：X1，温度：X2，水分：X3，酸性蛋白酶：X4，中性蛋白酶：X5，碱性蛋白酶：X6，GAD：X7），以相应时间点样本的GABA含量（Y）为纵坐标作散点图（图略），并运用相关性分析和多元回归分析等统计学分析方法研究淡豆豉炮制过程中各个影响因素在GABA形成中的主次地位，结果见表2～4。表2是各个因素与GABA的Pearson相关系数及其相应的显著性评价结果，表2结果表明在各个影响因素中水分（r＝0.，P＝0.）和酸性蛋白酶（r＝?0.，P＝0.）与GABA相关系数较小且无统计学差异（P＞0.05），因此这两者不适合和其他因素一起进行多元回归分析；将其他因素与GABA进行多元回归分析，结果表明回归方程调整后的决定系数（r2）为0.，剩余标准差为0.，该回归方程拟合度较好，表3是回归方程的方差分析，F＝.77，P＝0.＜0.05，结果表明该回归方程有统计学意义，表4是回归方程的参数估计，由表4可得回归方程为Y＝11.－0.X1－0.X2－0.X5＋0.X6＋0.X7，比较各项回归系数绝对值的大小，结果表明淡豆豉炮制过程中各指标影响GABA形成的主次地位为pH值＞温度＞GAD＞碱性蛋白酶＞中性蛋白酶。

4讨论

本实验初步分析了淡豆豉炮制过程中影响GABA富集的主次因素。研究结果表明：黑大豆和“黄衣上遍”阶段各样本GABA含量很低或未检出，进入“再闷”阶段GABA含量逐渐增加至再闷18d含量最高并稳定，再次证明了“再闷”的重要性和再闷15～20d的合理性；淡豆豉整个炮制过程中环境pH值处于中性偏弱酸性，其中“再闷”阶段炮制体系的pH值在6.0左右，可能由于再闷阶段兼性厌氧菌的大量生长产生乳酸、CO2等使环境pH值降低；淡豆豉炮制过程中体系的温度逐渐降低，“黄衣上遍”阶段最高达32～37℃，可能由于“黄衣上遍”阶段微生物种类数量丰富且代谢活跃致炮制体系温度升高；水分是微生物生长繁殖必不可少的营养物质和主要组成成分，约占细胞质量的70%～90%，在“黄衣上遍”阶段由于微生物的大量繁殖，炮制体系中的水分大部分被微生物吸收用于新陈代谢活动导致水分逐渐减少，进入“再闷”阶段后体系的湿度缓慢增加至再闷6d后基本稳定，可能是由于再闷阶段体系处于相对密闭环境。蛋白酶和GAD均是影响GABA形成的关键因素，其中蛋白酶是催化生成GABA原料Glu的关键酶，按其不同的性质可分为酸、中、碱性3种蛋白酶，本研究表明在淡豆豉炮制过程中起主要作用的是中性蛋白酶，这可能与炮制体系中pH值更为接近中性蛋白酶的最适pH值，酶活最高在发酵6d时达最高值，为.56U/g；碱性蛋白酶和酸性蛋白酶活力最高，分别为69.20、11.88U/g，与已报道[13]中性蛋白酶最适作用pH值（6～9）相吻合，此时高活力的蛋白酶使得大豆蛋白质大量分解，为“再闷”阶段提供GABA形成的原料奠定基础；GAD是催化Glu生成GABA最为关键的酶，研究表明偏弱酸性环境pH值为4～6、温度为30～50℃时更有利于GAD酶活的表达[14]，淡豆豉炮制过程中GAD酶活呈现先减后增的趋势，可能由于蒸煮过程致使大部分酶失活，进入“黄衣上遍”酶活逐渐增加，但增加幅度较小，发酵至第6天时体系含水量最少有利于“黄衣上遍”，此时微生物最为丰富，酶活较高，进入再闷阶段后，偏好于兼性厌氧环境的微生物大量繁殖，加之有利于GAD作用的弱酸性环境使得再闷阶段GAD酶活大幅增加，于再闷15d时酶活达最高值，为17.64U/g，与淡豆豉炮制过程中GABA的变化趋势相一致。

相关性分析是指对2个或多个具备相关性的变量参数进行分析研究，进而用以衡量变量参数之间的关联程度。本研究结果表明，淡豆豉炮制过程中各指标对GABA的形成具有不同程度的影响，其主次顺序为pH值（?0.）＞温度（?0.）＞GAD（0.）＞碱性蛋白酶（0.）＞中性蛋白酶（?0.）。其中pH值、温度、GAD、中性及碱性蛋白酶是其主要影响因素，pH值、温度和中性蛋白酶与GABA存在负相关性，GAD和碱性蛋白酶活力与GABA具有正相关性。

综上所述，本研究初步推测淡豆豉炮制过程中pH、温度、GAD、中性及碱性蛋白酶等指标对GABA的形成有重要影响，后期本课题组将通过荧光定量PCR明确淡豆豉炮制过程中优势微生物的数量和比例来进一步阐明GABA的形成机制。

本实验首次研究了淡豆豉炮制过程中影响GABA形成的主次因素，研究结果为进一步明确淡豆豉炮制过程中GABA富集的影响因素和形成机制奠定了基础。

参考文献（略）

来源：陈青峰，任佳秀，周姝含，熊京京，苏明声，王立元，翁美芝，谢卫华，谢小梅.淡豆豉炮制中影响γ-氨基丁酸富集的主次因素初步分析[J].中草药,,50(11):-.

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